Produtos naturais: cromatografia e espectrometria

Questão 1 (EBSERH/HU-UFMS)

Com base nos métodos de extração e isolamento de produtos naturais, assinale a alternativa INCORRETA.

(A)  O aumento da temperatura acelera o processo de extração dos princípios ativos, devido ao aumento da solubilidade dos solutos na solução extrativa.

O aumento de temperatura, geralmente, favorece a solubilização de um soluto qualquer em uma determinada solução. É evidente que esse princípio se aplica também aqui na obtenção de um extrato. A alternativa está correta.

(B)  O tempo de contato da droga com o solvente durante a maceração é muito variável indo de 30 minutos a dias, sendo o emprego da água não recomendado para processos extrativos prolongados.

A maceração consiste em nada mais, nada menos, que manter o solvente extrator em contato com o material a ser submetido à extração por um tempo prolongado, podendo ser de horas ou mesmo dias, sem a renovação do solvente, isto é, sem retirá-lo e sem verter outro solvente no lugar. Normalmente, o sistema é mantido à temperatura ambiente e sem agitação. No entanto, a maceração pode ser realizada de outras maneiras que favorecem o processo de extração. Quando realizada sobre aquecimento, a maceração é chamada de digestão, mas deve-se ter o cuidado de não elevar em demasiado a temperatura para evitar a degradação dos constituintes químicos da amostra; quando realizada com agitação, é chamada de maceração dinâmica; e quando o solvente é retirado e é vertido sobre o material vegetal um solvente novo (mesmo que seja o mesmo solvente, por exemplo, retirar metanol e verter metanol) é chamada de remaceração.

O emprego da água não é recomendado para processos extrativos prolongados para evitar que o extrato fungue. Além disso, geralmente (nem sempre), quando pretendemos extrair substâncias de plantas, visamos a extração de metabólitos especiais, como flavonoides, alcaloides, terpenos, esteroides, antraquinonas, etc., os quais podem ser extraídos com solventes orgânicos, como o metanol ou o etanol. O uso de um solvente muito polar para a extração, como a água, pode promover a extração de substâncias indesejáveis, como os carboidratos ou até mesmo proteínas, substâncias do metabolismo primário que, normalmente, não são responsáveis pelas atividades farmacológicas de uma amostra vegetal. A alternativa está correta.

(C) O tempo de extração é variável e depende exclusivamente da polaridade das moléculas do solvente e do soluto a ser extraído, que devem ser semelhantes.

De fato o tempo de extração é variável, mas a mesma não depende exclusivamente da polaridade do solvente ou do soluto a ser extraído, e não necessariamente devem possuir polaridade semelhante. Ao realizarmos uma extração, por exemplo, com metanol, este solvente polar será capaz de extrair substâncias de diferentes polaridades, desde metabólitos pouco polares, como os esteroides, até os mais polares, como compostos polifenólicos. A alternativa está incorreta.

(D) Embora as técnicas clássicas de maceração não se utilizem da agitação, o processo de maceração pode ser acelerado com a utilização de agitação contínua.

A agitação favorece a solubilização de um soluto em uma solução. O mesmo princípio pode ser aqui aplicado, quando ao invés de utilizarmos a maceração clássica, usamos a maceração dinâmica, ou maceração com agitação. A alternativa está correta.

  

      (E)  A percolação tem como característica comum a extração exaustiva das substâncias              ativas, sendo empregada para extração de substâncias presentes em pequenas                 quantidades no vegetal.

A percolação é um processo em que o solvente extrator é gotejado lentamente e continuamente sobre a amostra, fazendo o arrastamento dos seus constituintes químicos até o esgotamento, ou seja, até que não existam mais constituintes químicos a serem extraídos. A percolação é realizada quando se deseja obter extratos bem concentrados ou quando se deseja utilizar um gradiente de polaridade, isto é, diferentes solventes, com diferentes polaridades. Normalmente, inicia-se esse tipo de percolação com solventes menos polares, como o hexano, e a polaridade é aumentada usando em seguida o diclorometano, o acetato de etila ou o clorofórmio, por exemplo; e assim por diante, até um solvente mais polar, como o metanol. Gasta-se um volume menor de solvente do que na maceração, e o tempo de extração é tempo relativamente curto. A percolação é indicada quando é necessário extrair constituintes químicos presentes em pequena quantidade ou pouco solúveis. A alternativa está correta.

 Gabarito: C.

Questão 2 (EBSERH/MEAC-UFC/ HUWC-UFC)

Assinale a alternativa correta a respeito da cromatografia gasosa.

(A) Nessa técnica, a separação ocorre devido a diferentes tendências dos componentes ionizados de permutarem com íons da fase estacionária e, assim, serem deslocados para a fase móvel.

(B) Essa técnica permite a separação de substâncias voláteis arrastadas por um gás através de uma fase estacionária.

(C) Essa técnica é adequada para a separação dos componentes de soluções líquidas e utiliza-se quer para fins analíticos, quer para fins preparativos e em escala comercial.

(D) Essa técnica é baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na fase estacionária (líquido) e na fase móvel (líquido).

(E) Nessa técnica, as separações ocorrem através de interações eletrostáticas e forças de Van Der Waals entre a fase estacionária (sólido) e a fase móvel (líquido ou gás).

Na cromatografia gasosa (ou GC – gas chromatography), a fase móvel é um gás inerte, como o hélio, hidrogênio ou nitrogênio, os quais arrastam os constituintes da amostra ao longo de uma coluna contendo a fase estacionária. Esses constituintes químicos interagem mais ou menos com a coluna, o que permite sua separação. No final da coluna está presente um detector, normalmente um detector de massa (GCMS - gas chromatography coupled with mass spectrometry), que irá permitir a obtenção do espectro de massa de cada uma das substâncias da amostra. A partir da análise dos espectros de massa, muitas vezes é possível realizar a identificação dos constituintes da amostra. O GCMS ainda permite a quantificação de cada um dos compostos identificados. A grande limitação da técnica é a identificação apenas de constituintes voláteis, os quais podem ser carreados pelo gás de arraste.

Diante do exposto, observa-se que as alternativas A, C, D e E nada têm a ver com o que se discute. Gabarito: B.

Questão 3 (EBSERH/MEAC-UFC/ HUWC-UFC)

Considere a seguinte cromatografia de camada delgada:

Quais são os valores do fator de retenção (R_f) para A e B, considerando que o valor de X = 20cm e que as distâncias percorridas por A e B foram 7cm e 10 cm, respectivamente.

(A) A=0,35 e B=0,5.

(B) A=140 e B=200.

(C) A=7 e B= 10.

(D) A=14 e B= 20.

(E) A=27 e B=30.

Na cromatografia de camada delgada (CCD), a fase estacionária é um sólido, normalmente uma pequena placa revestida de sílica, embora outros tipos de CCD possam ser empregados a depender da característica da amostra a ser analisada, como a CCD em papel. A fase móvel é um líquido, um solvente apropriado para a análise desejada. Alguns milímetros da placa são mergulhados no solvente, que sobe pela placa por capilaridade, arrastando a amostra, que é aplicada mais ou menos na posição indicada na figura da questão.

A sílica é uma substância polar e tende a reter mais as substâncias polares, enquanto as menos polares tendem a ser mais arrastadas pelo solvente. Esse processo permite que os constituintes presentes na amostra sejam então separados, e cada constituinte forma uma banda (spot), que podem ou não serem visualizadas na luz visível. No caso de produtos naturais, as substâncias são normalmente visualizadas na luz UV, em torno de 365 e 254 nm. Substâncias “reveladores”, as quais pode ser borrifadas na placa após a corrida, podem ser utilizadas para melhor visualização das bandas: os reveladores reagem quimicamente com as substâncias e permitem sua visualização. A CCD é melhor mostrada na figura mais abaixo.

Cada substância da amostra irá migrar até um determinado ponto da placa, tornando possível o cálculo de seu fator de retenção (Rf - retention factor), que é inerente de cada substância, sempre que é utilizada a mesma fase móvel e a mesma fase estacionária: é a razão da distância percorrida pela substância e a distância percorrida pela fase móvel.

A questão acima, provavelmente, foi anulada pela banca, pois não é possível determinar o fator de retenção nem de A, nem de B, pois não é possível encontrar o quanto caminhou a fase móvel. Mas, para resolver, suponhamos que a fase móvel tenha caminhado até X: 20 cm. A percorreu 7 cm,enquanto B, percorreu 10 cm. Ora, para cacular o fator de retenção basta dividir 7/20 para A e 10/20 para B, e os valores encontrados serão 0,35 e 0,5, respectivamente. 

Gabarito: A.

Adaptado de Google imagens.

Na figura à esquerda, as amostras foram aplicadas (“spotiadas”) e a placa foi mergulhada em uma cuba contendo o solvente. Após 10 min (figura da direita), o solvente percorreu toda a placa, separando os constituintes químicos da amostra.

 

Visualização de bandas (spots) na luz UV. Adaptado de: Wagner et al., Plant Drug Analysis: a thin layer chromatography atlas, 2^nd edition, 1996.

Questão 4 (EBSERH/MEAC-UFC/ HUWC-UFC)

O termo extração significa retirar, da forma mais seletiva e completa possível, as substâncias ou fração ativa contida na droga vegetal. Assim, assinale a alternativa que apresenta métodos de extração a quente.

(A) Percolação e Soxhlet.

(B) Arraste por vapor d’água e maceração.

(C) Soxhlet e digestão.

(D) Decocção e infusão.

(E) Maceração e infusão.

Vamos entender como funcionam os processos de extração descritos acima. A percolação, digestão e a maceração nós já vimos na questão 1.

Para compreender melhor a extração por Soxhlet, vejamos a figura abaixo:

Aparelho de soxhlet (adaptado de Google imagens).

O material a ser extraído é colocado no cartucho, que pode se comprado no mercado, feito de celulose. No balão de fundo redondo, temos o solvente extrator, que é aquecido pela manta. Ao ser aquecido, o solvente evapora, mas ao chegar ao condensador, torna-se líquido novamente, e cai sobre o cartucho, onde está a amostra, extraindo suas substâncias. O solvente cai novamente no balão de fundo redondo, e o processo se repete. Esse método de extração possui a vantagem de se utilizar pequena quantidade de solvente, pois ele é constantemente renovado, além de ser eficiente. É mais empregado para extração de compostos voláteis, como óleos essenciais.

No arraste por vapor, temos o vapor de água que passa sobre o material vegetal. Isso faz com que as paredes celulares das plantas se abram e o óleo essencial é liberado, e carreado pela água até um condensador. No condensador, água e óleo se resfriam e caem em um recipiente ligado ao condensador, um béquer, por exemplo. Como água líquida e o óleo não se misturam, são facilmente separados após caírem juntos em um recipiente.

Extração de óleo essencial por arraste de vapor (fonte: adaptado de Google imagens).

Na infusão, ferve-se a água, utilizada como solvente extrator. Em seguida, a água quente é vertida sobre o material vegetal, e o recipiente é tampado por alguns minutos, enquanto os constituintes químicos são extraídos. É, na verdade, um chá. A infusão é feita, normalmente, para folhas. Já na decocção, o material vegetal é fervido juntamente com a água, também formando um chá, e é normalmente um processo utilizado para partes mais duras da planta, como semente, raiz e caule.

Agora podemos responder a questão. Os processos a quente descritos são decocção e infusão. Gabarito: D.

Questão 5 (EBSERH/HC-UFMG)

Para o isolamento e identificação de dois compostos obtidos a partir de uma planta popularmente utilizada como cicatrizante, um farmacêutico utilizou a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) de fase reversa. Os dois compostos identificados com a referida atividade possuem uma grande semelhança estrutural, diferindo apenas na posição 4 de um anel aromático, onde o composto A apresenta um hidrogênio e o composto B apresenta uma hidroxila. Com base no exposto, assinale a alternativa correta.

(A) Utilizando CLAE de fase reversa, o composto B apresentará um maior tempo de retenção que o composto A.

(B) Embora seja possível identificar os compostos, sua quantificação dependeria da utilização de outro método.

(C) Se o composto A apresentasse uma maior concentração que B, no cromatograma teríamos a formação de um pico menor, seguido de um pico majoritário.

(D) O composto em concentrações majoritárias, neste sistema, apresentará um menor tempo de retenção, no cromatograma, por ser de fase reversa.

(E) Não é possível a utilização de CLAE de fase normal para estas substâncias devido à similaridade entre os compostos.

A cromatrografia líquida de alta eficiência (HPLC – high performance liquid chromatography) é uma “CCD muito melhorada”, na qual são utilizadas pequenas quantidades de amostra e colunas recheadas com partículas muito pequenas da fase estacionária (partículas cujo tamanho geralmente está entre 2 e 5 micrômetros!), gerando uma separação muito mais eficiente do que em uma CCD.

No exemplo abaixo temos um cromatógrafo HPLC modelo 1200 Series (Agilent). É um modelo que nós do Farmaceuticofree, particularmente, temos experiência, mas existem diversos outros modelos no mercado, tanto dessa empresa como de outras, não menos competentes.

Figura extraída do manual de instrução do aparelho

A parte mais alta é onde ficam os solventes que constituirão a fase móvel (solvent comparment). No Agilent 1200 series, podemos misturar até 4 solventes. Abaixo temos o degaseificador (degasser) que retira os gases presentes na fase móvel, os quais não devem entrar no sistema, como o oxigênio, que pode prejudicar a coluna. Mais abaixo temos a bomba (pump) que gerará a pressão para a passagem do solvente. Abaixo da bomba temos o injetor, no caso um injetor automático (autosampler). Nesse compartimento colocamos a amostra, e um “braço robático” injeta uma seringa no frasco contendo a amostra (vial) e o injeta na coluna (column compartment). A amostra percorre toda a coluna e chega até um detector, no caso um detector UV-visível, ideal para o trabalho com produtos naturais (UV-Vis detector). As substâncias que absorvem a radiação programada pelo analista são detectadas, e aparecem numa tela de computador na forma de um sinal (ou pico). Abaixo do detector temos um coletor de frações (fraction collector), que coleta cada um desses “sinais” separadamente, separando, portanto as substâncias presentes na amostra.

Cromatograma após corrida em HPLC Agilent 1200 series. Cada sinal representa uma substância presente na amostra (adaptado do manual de instruções do aparelho).

Existem diversos tipos de coluna contendo diversos tipos de fase móvel diferentes disponíveis para compra no mercado. No entanto, no caso de produtos naturais, normalmente utilizamos colunas chamadas de fase normal ou fase reversa. As colunas de fase normal tem o mesmo fundamento que vimos na CCD, enquanto na fase reversa temos uma fase estacionário apolar, por isso fase reversa. Nesse último caso, as substâncias polares são menos retidas, e saem primeiro do que as menos polares no final da corrida, as quais interagem mais com a fase estacionária. Em outras palavras o tempo de retenção de substâncias polares são menores do que os tempos de retenção de substâncias apolares em uma coluna de fase reversa. Em uma coluna de fase normal é o inverso.

Agora podemos analisar a questão!

Temos um composto A e um composto B. O B é um composto mais polar, pois tem uma hidroxila, ausente no A. Ora, se estamos utilizando a fase reversa, o composto B interage menos com a coluna, percorrendo-a mais rápido, e seu sinal aparece primeiro (tempo de retenção menor). Podemos excluir a alternativa A.

O HPLC pode ser utilizado também para identificação e quantificação de uma substância na amostra, desde que se tenha um padrão, isto é, a mesma substância que se procura na amostra, a qual deve ter o mesmo comportamento que o padrão durante a análise. Portanto, podemos excluir a letra B.

As alternativas D e E não fazem o menor sentido. Mas a C sim: compostos que são encontrados em maiores concentrações na amostra, normalmente (mas não necessariamente) apresentarão um pico maior. Se A está em maior concentração que B, de fato deve ser representado por um pico maior. E se A é menos polar que B, interagirá mais com a coluna, e sairá dela depois de B.

Gabarito: C.

Questão 6 (EBSERH/HUSM-UFSM)

Vários métodos analíticos são comumente utilizados para identificação e caracterização de substâncias com potencial ou não de atuarem como fármacos. Muitos deles são oficialmente descritos e padronizados pela Farmacopeia Brasileira, como a espectrometria e a cromatografia. Sobre estes dois métodos analíticos, assinale a alternativa correta.

(A) A partir do método de espectrofotometria de absorção, é possível realizar a identificação de substâncias, porém não é possível a sua quantificação.

A espectrometria de absorção consiste na emissão de radiação sobre a amostra. Parte dessa radiação é absorvida pela amostra, e a parte que não é absorvida é lida por um aparelho espectrométrico. Quanto maior a concentração da amostra, maior será a absorção da radiação, o que permite quantificar a amostra, isto é, determinar com a concentração da amostra solubilizada em uma determinada solução. Assim, a alternativa está incorreta.

(B) A separação de substâncias não é possível a partir da cromatografia em papel, devendo, para este fim, serem aplicados outros tipos de cromatografia com maior eficiência.

A cromatografia em papel é semelhante é um tipo de CCD, mas ao invés de sílica, temos papel. Ela é perfeitamente aplicável, dependendo das características da amostra. A alternativa está incorreta.

(C) A espectrofotometria de absorção, de acordo com o intervalo de frequência da energia eletromagnética aplicada, pode ser dividida em ultravioleta, visível e infravermelho.

Sim, são as diferentes formas de radiação que podem ser aplicadas sobre uma amostra. A alternativa está correta.

(D) Na cromatografia líquida de alta eficiência, a fase fixa (sólida) é sempre formada por compostos polares, enquanto que a fase móvel (líquida) é constituída por compostos de baixa polaridade.

Não faz sentido. Como já vimos, podemos ter uma fase estacionária polar ou não (fase reversa), e a fase móvel também pode variar de polaridade. Alternativa incorreta.

(E) Quanto maior a concentração molar de uma amostra analisada por espectrofotometria, menor será o valor de sua absorbância.

Não, como vimos na alternativa A, é o contrário.

Gabarito: C.

Questão 7 (EBSERH/HUSM-UFSM)

No processo de desenvolvimento de um fitoterápico, a escolha do método extrativo levou em consideração a estabilidade das substâncias a serem extraídas e, deste modo, métodos de extração com aquecimento tiveram de ser evitados. Com base no exposto, assinale a alternativa que apresenta somente métodos de extração a frio que poderiam ser utilizados no preparo do fitoterápico em questão.

(A) Maceração e decocção.

(B) Arraste por vapor d’água e infusão.

(C) Turbólise e digestão.

(D) Maceração dinâmica e digestão.

(E) Remaceração e percolação.

Todos os processos de extração presentes na questão, já foram aqui explicados, exceto a turbólise. Nesse processo, o material vegetal é colocado juntamente com um solvente a frio e submetido a uma forte força de cisalhamento (“cortes”), triturando o material. O processo é feito também com muita agitação, em alta velocidade, exercida por um aparelho chamado turbolizador. Devido à grande trituração e agitação, o processo é bastante eficiente, todavia é gerado bastante calor, o qual pode degradar constituintes químicos importantes da amostra. Não é recomendado o uso do turbolizador para materiais duros, como caules e raízes.

Gabarito: E.